Soie d'araignée de bactéries phototrophes

Comme nous le savons depuis longtemps, la nature est une excellente source d'inspiration pour de nombreuses études, découvertes et expérimentations. Les oiseaux et les insectes ailés nous ont montré que le ciel est tout à fait réalisable, les mammifères aquatiques nous ont montré comment prolonger notre séjour sous l'eau et les araignées ont prouvé que même les plus petites créatures peuvent créer quelque chose d'incroyable. Dans l'étude que nous envisageons aujourd'hui, des scientifiques de l'Institut de recherche physique et chimique (Wako, Japon) ont trouvé un moyen de créer une toile artificielle à l'aide de bactéries phototrophes. Comment ont-ils exactement réalisé cela, à quel point les toiles d'araignées résultantes sont naturelles et pourquoi des bactéries phototrophes ont-elles été utilisées? Des réponses à ces questions et à d'autres nous attendent dans le rapport des scientifiques. Aller.

Base de recherche

Pour beaucoup de gens, les araignées sont "oh mon Dieu, éloigne-le de moi!" ou "ugh, quel dégoûtant." Cependant, en mettant de côté les phobies et les préjugés contre ces créatures, on peut considérer à quel point ces prédateurs à huit pattes sont uniques. L'anatomie de l'araignée est littéralement faite pour la chasse parfaite. D'une part, il existe un poison qui peut paralyser voire tuer des proies ou l'ennemi. D'autre part, il existe des organes sensoriels bien développés (en particulier le toucher dû aux trichobothries (poils) dans tout le corps). La carte de visite des araignées, qui est devenue la base de nombreuses métaphores et slogans, est leur toile.





Une vidéo sur la façon dont les araignées produisent leur célèbre site Web.



À la base, une nappe est une protéine dont la composition est riche en glycine (C ₂ H ₅ NO ₂ ), alanine (NH ₂ -CH (CH ₃ ) -COOH) et sérine (HO ₂ C-CH (NH ₂ ) CH ₂ OH ). Une toile d'araignée est formée dans une glande spéciale, où elle est sous forme liquide.



Lorsque la sécrétion de la glande est sécrétée par de nombreux tubes en rotation, des verrues d'araignées spéciales en forment des fils, que l'araignée utilise pour construire ses pièges mortels.



Les fils de toile d'araignée sont uniques car leurs propriétés mécaniques sont supérieures à celles de nombreux autres matériaux. Par exemple, la résistance à la traction d'une toile d'araignée pour une araignée ordinaire ( Araneus diadematus ) est de 1,1-2,7 GPa, pour un cheveu humain, elle est de 0,25 GPa et pour l'acier, elle est de 0,4-1,5 GPa. La densité de la soie d'araignée est 1/6 de celle de l'acier (1,3 g / cm ³ ). Autrement dit, si vous faites le tour de la Terre avec une toile, son poids ne sera que de 500 grammes. La densité d'énergie d'environ 1,2 × 108 J / m ³... De plus, la soie d'araignée est extrêmement flexible, c'est-à-dire peut s'étirer jusqu'à 5 fois sa longueur d'origine (dans un état détendu) sans aucune interruption. La résistance aux chocs des toiles d'araignées est comparable à celle des fils de polyaramide. Les araignées ne sont pas extrémophiles, mais leurs toiles peuvent facilement survivre à des températures de -40 ° C à 220 ° C. De plus, les propriétés biodégradables et biocompatibles de la soie la rendent adaptée aux applications médicales.





Comparaison de la résistance à la traction du fil d'acier et de la soie d'araignée (densité correspondante).



Il est également curieux qu'un type d'araignée puisse produire plusieurs types de toiles dont les propriétés et les applications diffèrent (les araignées de l'espèce Argiope argentata produisent jusqu'à 5 variantes de la toile):

• pour les bords extérieurs et le cadre en toile (très résistant);
• pour les zones de capture de proies (très collantes, élastiques et durables);
• ( );
• ( 2 3 );
• ;
• .

Ce n'est qu'une brève description de la soie d'araignée, mais même cela suffit pour comprendre le caractère unique de cette substance. C'est pourquoi de nombreux scientifiques tentent depuis longtemps de créer un équivalent artificiel du Web. Pour beaucoup, c'est assez réussi. Cependant, le problème de la production de masse reste non résolu.



Dans les travaux que nous envisageons aujourd'hui, les scientifiques ont proposé une solution à ce problème. Il consiste à utiliser la bactérie violette Rhodovulum sulfidophilum , qui possède les propriétés à la fois phototrophes * et halophiles * .

Les phototrophes * sont des organismes qui utilisent la lumière pour générer de l'énergie.

Les halophiles * sont un type d'extrémophile qui vit dans des conditions de salinité élevée.

R.sulfidophilum est une bactérie photosynthétique anoxygénique * marine avec différentes caractéristiques métaboliques qui produit du biohydrogène, des bioplastiques et des acides nucléiques extracellulaires.

Photosynthèse anoxygénique * - contrairement à la photosynthèse conventionnelle, l'oxygène moléculaire n'est pas formé pendant la photosynthèse anoxygénique.

Mais la compétence la plus importante de R.sulfidophilum pour les scientifiques est sa capacité à se développer dans des conditions photoautotrophes grâce à l'utilisation de ressources bon marché et renouvelables telles que la lumière (énergie), le CO ₂ (source de carbone) et le N ₂ (source d'azote) par le biais des processus de photosynthèse et de fixation. azote. De plus, R.sulfidophilum prospère dans l'eau de mer, réduisant ainsi le risque de contamination biologique pendant la culture.



Ces dernières années, de bons résultats ont été obtenus dans la production de masse de spidroïne (MaSp, protéine de soie d'araignée) à l'aide d'organismes hôtes recombinants ( bactérie Escherichia coli , levure Pichia pastoris , ver à soieBombyx mori , tabac, cultures de cellules de mammifères, etc.).



Les auteurs de ce travail ne nient pas le succès de leurs prédécesseurs, mais notent les volumes de production extrêmement faibles et le coût assez élevé du produit final en raison du coût élevé de la production elle-même (dans le cas de la fermentation microbienne, 70% des coûts de production sont des matières premières).



Dans leur étude, les auteurs proposent une nouvelle méthode de production économique et efficace de soie d'araignée à l'aide de la bactérie R. sulfidophilum , capable de produire une séquence répétée hydrophobe MaSp1 (spidroin-1) en utilisant une petite quantité de matière organique dans des conditions de croissance photohétérotrophe ou photoautotrophique.

Résultats de recherche

Il a d'abord fallu préparer la bactérie R.sulfidophilum .



La possibilité d'introduire un ADN plasmidique exogène dans R.sulfidophilum par conjugaison bactérienne * en utilisant des plasmides obtenus à partir de pCF1010 et d' E. Coli S17-1 comme souche donneuse a déjà été rapportée .

Conjugaison * - transfert unidirectionnel d'une partie du matériel génétique lors du contact direct de deux cellules bactériennes.

Dans cette étude, il a été décidé d'utiliser un vecteur différent (pBBR1MCS-2) contenant le gène de résistance à la kanamycine, le gène mob codant pour une nucléase spécifique et la source de transfert ( oriT * ), largement utilisés dans la conjugaison bactérienne gram-négative.

oriT * est une séquence courte (jusqu'à 500 pb) nécessaire pour le transfert de l'ADN le contenant d'un hôte bactérien à un receveur lors de la conjugaison bactérienne.

Dans le chromosome de R.sulfidophilum (numéro d'accession NZ_CP015418), deux gènes de résistance au tellurite codant pour une protéine de résistance au tellurite de la famille TerB étaient présents aux loci A6W98_RS06280 et A6W98_RS17070.



Les traits de résistance à la kanamycine et au tellurite ont été utilisés comme marqueurs pour la sélection de conjugants positifs de R. sulfidophilum .



Le plasmide * pBBR1-Ptrc-MaSp1 contenait:

• le promoteur * trc (Ptrc), qui est un puissant promoteur constitutif hybride dans E. coli;
• la séquence "AGGAGA" de la région de liaison au ribosome (RBS);
• MaSp1 Nephila clavipes, ( ) E.coli (1a, 1b).

* — , .

* — , - ( ).

Environ 0,4 g de masse cellulaire humide (CWM à partir de la masse cellulaire humide ) a été obtenu à partir de 50 ml de culture de R. sulfidophilum recombinante cultivée jusqu'à croissance stationnaire dans des conditions photohétérotrophes, à savoir à partir de bouillon de mer (MB de bouillon marin ) avec éclairage LED à (730 nm, 20-30 W / m ² ) pendant 4 jours.





Image # 1



Malgré le fait que la surexpression des protéines MaSp1 recombinantes n'a pas été clairement détectée dans toutes les cultures recombinantes de R. sulfidophilum par électrophorèse sur gel de polyacrylamide / SDSPAGE ( 1c), l'expression positive des protéines MaSp1 a été confirmée par immunotransfert de protéines pour toutes les cellules de R.sulfidophilum recombinantes créées portant pBBR1-Ptrc-MaSp1- (1-mère, 2-mère, 3-mère ou 6-mère) ( 1d ).

K-mesures * - sous-séquences de longueur k contenues dans une séquence biologique.

Le domaine uniquement répétition dans les constructions résultantes contient 33 résidus d' acides aminés de la forme suivante:



NH ₂ -SGRGGLGGQGAGAAAAAGGAGQGGYGGLGSQGT-COOH.



Le poids moléculaire théorique des protéines cibles, y compris les séquences de non-spin (régions de clivage de His-Tag, S-Tag, entérokinase et thrombine) à l'extrémité N-terminale est de 7,9 kDa pour 1-mère (81 aa); 10,5 kDa pour 2-mer (114 aa); 13,1 kDa pour le 3-mère (147 aa) et 20,9 kDa pour le 6-mère (246 aa).

Oui - désignation de l'unité de masse atomique; kDa - kilodalton (1 kDa = 103 Da).



L'allèle dominant est indiqué par une lettre majuscule (A contre a). Puisque chaque parent fournit un allèle, les combinaisons suivantes sont possibles: AA, Aa et aa.

En plus de confirmer l'expression des protéines MaSp1, leur quantité de protéines MaSp1 obtenues à partir de cultures recombinantes de R. sulfidophilum a également été estimée : ~ 3-10 mg / L (1-mer = 3,4 mg / L; 2-mer = 3,9 mg / L ; 3-mère = 10,2 mg / l; 6-mère = 6,8 mg / l) ou 3,5–6,9% de la quantité totale de protéines. À titre de comparaison, l'expression hétérologue des spidroines dans le système recombinant bien connu et largement utilisé d' E. Coli est capable de produire seulement environ 0,3 à 1,2 mg / L de spidroine purifiée.



Le résultat le plus surprenant, selon les scientifiques, dans cette étude est la démonstration d'usines de cellules microbiennes, basées sur des organismes photosynthétiques marins, dans lesquelles un régime de croissance photoautotrophique peut être appliqué en utilisant des matières premières non alimentaires renouvelables et de l'eau de mer comme milieu de culture.



R.sulfidophilum , portant pBBR1-Ptrc-MaSp1- (6-mer), a été cultivé dans de l'eau de mer artificielle (Daigo ASW à partir d'eau de mer artificielle) lorsqu'il était éclairé par des LED (730 nm, 20-30 W / m ² ) avec le sel de bicarbonate (1 g / l) comme source de carbone inorganique et d'azote gazeux (0,5 l / j) comme source d'azote. Le temps de culture était de 7 jours ( 2a ).





Image n ° 2



La plus grande unité constitutive, MaSp1- (6-mer), a été choisie pour des expériences ultérieures parce que le poids moléculaire plus élevé de MaSp1 entraînerait une résistance à la traction plus élevée de la fibre de soie d'araignée. Le bicarbonate de sodium a été utilisé pour fournir du carbone inorganique parce que les sels de bicarbonate ont une solubilité plus élevée et des coûts de transport inférieurs à ceux du gaz CO ₂ .



Des chercheurs précédents ont mené des expériences pour déterminer les conditions d'éclairage nécessaires à la croissance des cellules de R. sulfidophilum : intensité (8 et 50 W / m ² ) et longueur d'onde (730, 800 et 850 nm). Cette étude a évalué les effets de croissance de R.sulfidophilum recombinantplusieurs nutriments supplémentaires (extrait de levure, vitamine, fer et phosphore) qui sont déficients dans les milieux ASW.



La masse cellulaire sèche (CDM) a diminué de 0,90 g / L (avec tous les nutriments) à 0,66 g / L en l'absence d'extrait de levure et à 0,39 g / L en l'absence de phosphore. Il a également été déterminé que R.sulfidophilum recombinant ne peut pas se développer dans des milieux ASW sans NaHCO ₃ , N ₂ gaz ou phosphore ( 2b ; ASW + N ₂ , ASW + C + N ₂ , ASW + C + P et ASW + P + N ₂ ).



CDM (~ 0,4 g / L) dans ces variantes de milieu ASW provenait très probablement d' inoculants *ou inoculum même après que les échantillons ont été lavés avec du chlorure de sodium à 2%. Ainsi, des sources de carbone, d'azote et de phosphore sont nécessaires pour la croissance de R. sulfidophilum recombinant en milieu ASW.

Inoculant microbiologique * - produits biologiques contenant des cultures vivantes de micro-organismes utiles pour les plantes.

Comme prévu, la croissance cellulaire a augmenté de manière significative de 0,34 ± 0,02 g / L (ASW + C + N ₂ ) à 0,58 ± 0,08 g / L (augmentation de 1,7 fois) et 0,81 ± 0,02 g / L (augmentation de 2,4 fois) en présence d'extrait de levure (ASW + C + N ₂ + YE) et de phosphore (ASW + C + N ₂ + P), respectivement.



Le CDM le plus élevé a été obtenu en ajoutant de l'extrait de levure et du phosphore, donnant 1,04 ± 0,06 g / L (une augmentation de 3,1 fois).



Le rendement de ~ 0,2 mg / L de protéine recombinante MaSp1 (2% de la quantité totale de protéines) a été observé dans les conditions ASW + N ₂ , ASW + C + N ₂ , ASW + C + P et ASW + P + N ₂ ( 2c et 2d). La production de la protéine MaSp1 a été facilitée par l'ajout d'un extrait de levure, ce qui a considérablement augmenté le rendement de la protéine MaSp1 de 0,12 ± 0,10 mg / L (ASW + C + N ₂ ) à 3,93 ± 2,76 mg / L (ASW + C + YE + N ₂ ).



L'ajout de levure a également augmenté le pourcentage de MaSp1 dans le volume total de protéines de 1,2 ± 1,0 à 6,9 ± 5,3%. Fait intéressant, l'ajout de phosphore, bien qu'influençant positivement l'augmentation du CDM, a affecté négativement la production de la protéine MaSp1.



Par rapport à ASW + C + YE + N ₂ dans le milieu ASW + C + YE + P + N ₂ , le rendement de la protéine MaSp1 a diminué à 2,71 ± 1,09 mg / L et le pourcentage de MaSp1 dans les protéines totales a diminué à 3,9 ± 1,6%.



L'explication de ces différences de production de protéines selon le milieu de culture peut résider dans la fonctionnalité de chacun des composants. Par exemple, l'extrait de levure est principalement une source d'azote qui favorise la biosynthèse des protéines. Pendant ce temps, le phosphore est un macronutriment et un hétéro-élément important dans de nombreux composés cellulaires importants, ce qui favorise la croissance des producteurs primaires.



Pour obtenir la soie d'araignée dans sa forme habituelle, il était nécessaire de purifier MaSp1.





Image # 3



Pour obtenir suffisamment de protéine MaSp1 pour l'extrusion de fibres, une fermentation ( 3a ) a été réalisée pour produire MaSp1- (6-mer).



En général, la taille des spidroins est positivement corrélée avec la résistance à la traction à un poids moléculaire spécifié. Les protéines plus grandes ont plus d'interactions interchaînes et intrachaines, plus d'enchevêtrements et moins de défauts de chaîne d'extrémité.



La purification de MaSp1- (6-mère) a été réalisée en utilisant une chromatographie d'affinité à travers une étiquette histidine, qui était présente à l'extrémité N-terminale de la cassette de gène MaSp1, et une chromatographie par filtration sur gel. En conséquence, environ 10 mg de MaSp1- (6-mère) ( 3b ) purifiée ont été obtenus à partir d'environ 40 g de CWM.



Les fibres de soie ont été préparées par pipetage de MaSp1- (6 mesures) purifié à 10% en poids dissous dans de l'hexafluoroisopropanol (HFIP) dans un bain de coagulation suivi d'une traction manuelle avec une pince ( 3c). Les meilleurs résultats ont été obtenus en utilisant du 2-propanol à 90% comme bain de coagulation, ce qui a provoqué une déshydratation relativement douce, ce qui a permis un tirage efficace du fil. L'analyse par microscopie électronique à balayage a montré que les fibres ont un diamètre de 10 à 20 µm et une surface recouverte de rainures parallèles à l'axe des fibres. La fractographie a montré que la structure interne était constituée de microfibrilles ( 3d et 3e ).



Pour une connaissance plus détaillée des nuances de l'étude, je vous recommande de consulter le rapport des scientifiques et des éléments supplémentaires .

Épilogue

Dans ce travail, les scientifiques ont parlé de la création réussie d'une micro-usine pour la production de la protéine MaSp1. Le principal leader de cette production est la bactérie R.sulfidophilum , grâce à laquelle il a été possible d'obtenir l'expression photohétérotrophique d'une protéine de toile d'araignée artificielle dans des conditions de croissance photoautotrophique.



En d'autres termes, les scientifiques ont génétiquement modifié la bactérie pour produire de la soie d'araignée, plus précisément la protéine MaSp1, qui en est une composante importante. En plus des manipulations génétiques, il était également nécessaire d'établir les conditions optimales pour la culture de la bactérie. Il s'est avéré que l'environnement idéal est l'eau de mer artificielle. De plus, il était nécessaire d'utiliser de l'azote gazeux et de l'extrait de levure comme sources de nutriments. Ensemble, ces constituants conduisent à une croissance bactérienne efficace et donc à la production de protéines de toile d'araignée.



Il est également important que les fibres de toile d'araignée obtenues à partir de la protéine aient une structure très similaire à celle des fibres naturelles produites par les araignées de l'espèce Nephila .



Les scientifiques notent que leur méthode de culture de protéines de soie d'araignée pourrait également être utilisée pour cultiver d'autres substances. À l'avenir, les auteurs de l'étude prévoient d'améliorer leur micro-usine pour augmenter le volume de production de protéines et améliorer les caractéristiques moléculaires du produit résultant.



Selon les scientifiques, leurs travaux peuvent contribuer à résoudre de nombreux problèmes: crises énergétique, hydrique et alimentaire, problèmes de déchets solides, réchauffement climatique, etc. La raison de ce large éventail de possibilités est le fait que des usines comme celles-ci produisent des matériaux biodégradables et biocompatibles en utilisant un processus neutre en carbone.



Merci pour votre attention, restez curieux et passez une bonne semaine de travail, les gars. :)

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