Structure cristalline de S. aureus Cas9 dans un complexe avec l'ARNr et son ADN cible
Dans les articles précédents, vous avez demandé de parler plus en détail de CRISPR / Cas9 et des approches de l'édition du génome. Je n'ai tout simplement pas inclus un matériel aussi volumineux dans le dernier message. Et je n'inclurai pas, par exemple, la méthode TALEN, qui peut être potentiellement plus précise et présente ses avantages. Mais chérie, oui.
Essayons de parcourir la méthode déjà bien décrite de modification génétique utilisant CRISPR-Cas9 et regardons un peu plus largement les perspectives qu'elle nous ouvre. Je m'intéressais énormément à la direction de la transplantation xénogénique des porcs aux humains. Les premières méthodes de "pré-correction" ont montré qu'une telle greffe de porc est tuée par le corps à l'intérieur quelques minutes . Mais la méthode n'a pas du tout été écartée. Pourtant, c'est une manière prometteuse de ne pas attendre la mort d'un autre donneur potentiel d'organes, mais de les cultiver à l'avance. Ensuite, il s'est avéré que les porcs portent également un paquet de rétrovirus spécifiques qui sont intégrés dans leur génome et peuvent provoquer une épidémie d'une nouvelle xénozoonose. Et les virus doivent également être sélectionnés avant la transplantation. Et quelque part ici, des gens en blouse blanche apparaissent sur la scène, faisant quelque chose d'incompréhensible dans leurs laboratoires ...
L'antivirus bactérien qui a tout chamboulé
En 1987, CRISPR a été découvert par des scientifiques japonais dirigés par Yoshizumi Ishino. À ce moment-là, ils ont attiré l'attention sur les répétitions inhabituelles dans le génome d'E. Coli, mais n'y ont pas attaché une importance particulière. Et ce n'est que lorsque des répétitions similaires ont été trouvées chez les archées, qui sont génétiquement très éloignées d'E. Coli, qu'ils ont commencé à rechercher des structures similaires chez d'autres procaryotes. Ces extraits sont appelés CRISPR - regroupés régulièrement de courtes répétitions palindromiques espacées. Un peu plus tard, des protéines spéciales associées à CRISPR, Cas ( CRISPR en tant que protéine associée ), ont également été découvertes. Bien découvert et découvert, semble-t-il. Mais ils étaient le début d'une nouvelle révolution biotechnologique.
Maintenant, je vais essayer de vous dire comment cela fonctionne et pourquoi les bactéries en ont besoin. Les bactéries adoreraient survivre. Mais ils aiment parasiter les virus. Quand quelqu'un vous mange - c'est désagréable et vous devez faire quelque chose. En conséquence, la réponse était un mécanisme complexe mais extrêmement intéressant. La bactérie stocke énormément dans un morceau de son génome les signatures de tous les méchants qui tentent de l'infecter. Ce sont les mêmes régions palindromiques répétitives - CRISPR. Ils travaillent avec des protéines du groupe Cas. Nous nous intéressons à la clé Cas9. À quoi cela ressemble-t-il en direct, s'il est un peu simplifié?
Si ce système ne fonctionne pas, la cellule bactérienne est incapable de distinguer le génome viral, soigneusement introduit par le bactériophage, du sien. Et le système peu astucieux de synthèse protéique est immédiatement réorienté vers la libération de nouvelles générations de phages. La cellule meurt.
Si CRISPR / Cas9 est déclenché, le processus est différent. La bactérie utilise les données enregistrées dans CRISPR pour créer un ARN témoin. Le complexe protéique commence à dérouler l'ADN pour le tester avant le «lancement». Si la séquence correspond aux signatures virales enregistrées dans CRISPR, Cas9 déclenche l'alarme et coupe immédiatement le fragment ennemi reconnu. Autrement dit, même si un virus est intégré dans le génome bactérien au niveau «micrologiciel», il en sera supprimé dès que l'antivirus intégré le reconnaîtra.
prix Nobel
Emmanuelle Charpentier et Jennifer Doudna ont reçu le prix Nobel de chimie 2020 pour la création de nouvelles technologies permettant à CRISPR-Cas9 d'effectuer l'édition du génome. Cette technologie a permis de remplacer les méthodes plus précises à l'époque, mais plus complexes et coûteuses, des doigts de zinc et des nucléases TALEN. Les méthodes antérieures nécessitaient le développement, l'expression et la validation d'une toute nouvelle paire de polypeptides pour chaque nouveau locus cible. Et CRISPR-Cas9 a donné un outil standard, lorsqu'il est utilisé dans la version minimale, il suffit d'obtenir la séquence de contrôle nécessaire, selon laquelle Cas9 trouvera la zone nécessaire à la dissection.
D'accord, nous avons coupé l'ADN d'un humain, d'une levure ou d'un rat test. C'est cool, mais maintenant nous avons deux morceaux cassés et une chaîne détruite. Il existe plusieurs options pour la couture arrière.
Vous pouvez essayer de faire correspondre les pièces coupées en utilisant la méthode de jonction d'extrémité non homologue. Il est sur la droite. Pour faire simple, dans cette version, nous essayons simplement d'ancrer directement la double rupture et de la souder en un seul tout. Ce mécanisme est plutôt inefficace, dans le processus de "montage" des parties d'extrémité individuelles peuvent tomber. En conséquence, de petits fragments sont souvent perdus dans la zone de rupture ou, au contraire, de courts inserts apparaissent. Cette approche désactive généralement le gène de manière irréversible, le rendant défectueux.
La deuxième option est plus intéressante. Il est dans l'illustration à droite. La réparation par recombinaison homologue implique le remplacement d'une séquence délétée par une nouvelle séquence complémentaire d'un modèle de réparation créé par le chercheur lui-même. En conséquence, il est possible non seulement de désactiver le gène d'une manière ou d'une autre, mais de remplacer la séquence mutante par la séquence normale.
Le principal problème de la méthode est qu'elle est probabiliste. Oui, dans un grand pourcentage de cas, cela fonctionnera exactement comme il se doit. Mais dans de nombreuses cellules, cela ne donnera pas l'effet escompté ou brisera quelque chose au diable. Et c'est bien si seulement des cellules individuelles en meurent et ne deviennent pas, par exemple, des cellules tumorales. Par conséquent, tous ces changements doivent être minutieusement testés. Heureusement, des approches relativement nouvelles améliorer la spécificité en créant un Cas9 personnalisé peut réduire le nombre de coupes erronées à presque zéro.
Xénogreffes
Comme je l'ai déjà dit, l'utilisation massive de ces techniques arrête la spécificité. Si notre merveilleuse molécule manque simplement 20% des cellules, ce n'est pas grave. Cela signifie que 80% des cellules humaines avec une mutation congénitale sont fixées et commenceront déjà à produire la bonne enzyme, à se diviser adéquatement ou à faire autre chose correctement. En règle générale, c'est plus que suffisant pour qu'une personne devienne cliniquement saine.
Dans cette section, je voudrais parler un peu de la façon dont l'édition du génome peut potentiellement résoudre le problème du don d'organes. Je dois dire que le manque d’organes pour la transplantation semble très triste. Des temps d'attente énormes et de nombreux problèmes éthiques.
Le nombre de transplantations d'organes effectuées en Russie est des centaines de fois plus faibleBesoins. Si le même rein peut être transplanté à partir d'un parent approprié, alors une transplantation cardiaque est déjà garantie pour signifier la mort du donneur. L'un des domaines clés dans la recherche d'une source illimitée d'organes est la xénotransplantation. Il s'agit d'une option pour la transplantation de tissus et d'organes entre différentes espèces. L'un des donneurs les plus appropriés en termes de structure et de taille pour l'homme est un porc , assez curieusement. Les primates, bien que génétiquement plus proches, sont généralement beaucoup plus petits et très coûteux à reproduire. Malheureusement, les premières expériences avec des greffes d'organes de porcs ont montré qu'elles commençaient à rejeter avec une réponse suraiguë quelques minutes après avoir été connectées à la circulation sanguine.
Comment modifier un cochon
Pour que la greffe ne soit pas rejetée, il faut au moins assommer les gènes cibles responsables de la synthèse des protéines les plus étrangères chez nous. La première de ces protéines est l'enzyme alpha-1,3-galactose, qui, chez tous les primates, est irréversiblement cassée au cours de l'évolution. C'est lui qui provoque l'apparition du rejet en quelques minutes . La correction génétique a permis de créer une race de porcsavec un gène désactivé responsable de la synthèse de l'enzyme - porc GTKO. Bien que cela ait considérablement ralenti le processus de rejet, cela ne l'a pas complètement arrêté. Il s'est avéré que l'acide N-glycolylneuraminique et la β1,4 N-acétyl galactosaminyltransférase, absents chez les primates, sont également problématiques. Ces gènes ont également été éliminés et les porcs GGTA1 / CMAH / β4GALNT2 KO ont été obtenus avec les trois gènes désactivés en même temps. Vraisemblablement, cela peut pratiquement neutraliser la réaction de rejet . En théorie, s'il s'avère également forcer les cellules de porc à synthétiser la glycoprotéine de surface CD47 d'une personne, alors la compatibilité sera tout à fait excellente .
Il y avait une publication très prometteuse en 2018 sur la transplantation cardiaque des porcs OGM aux babouins. Sur les 5 babouins, un seul avait des problèmes, un œdème pulmonaire a commencé pour des raisons chirurgicales et a dû être retiré de l'expérience à l'avance. Les autres ont survécu jusqu'à la fin de leur période d'expérimentation en bonne santé. Deux à trois mois et deux à six mois. Il y a eu des problèmes dus à la croissance de l'organe, car le cœur d'un porc est plus gros que celui d'un babouin, mais pour une personne, ce ne sera pas un problème.
Y a-t-il un nouveau VIH devant nous?
Arbre phylogénétique du VIH et des virus apparentés chez les chimpanzés
Il semblerait qu'un avenir radieux nous attend, où un troupeau séparé de porcs de laboratoire spéciaux paîtra pour la production d'organes de donneurs. Mais là aussi, de nombreux problèmes éthiques émergent. Je soupçonne qu'une telle méthode sera inacceptable pour les représentants de plusieurs religions, ce qui la rend automatiquement inaccessible à une grande partie de la population mondiale.
Les porcs ont également des rétrovirus. Ceux-ci incluent, par exemple, un lentivirus aussi merveilleux que le virus de l'immunodéficience humaine et les virus primates associés. On pense que c'est le virus primate qui a provoqué l'épidémie massive de VIH dans les années 70 du siècle dernier. Et maintenant, une personne ne sait pas quoi faire de lui. Les porcs sont porteurs de PERV - rétrovirus endogènes porcins. Et vous ne pouvez pas vous débarrasser de ces virus par une sélection soigneuse et des mesures anti-épidémiques, car les virus sont déjà fermement ancrés dans le génome de leurs cellules. La recherche a été menée ce qui devrait donner une solution possible. Pour commencer, ils ont pris des cellules de porc et les ont cultivées dans la même culture que les cellules embryonnaires d'un rein humain. Le plus ennuyeux est qu'ils ont pu identifier des cellules humaines infectées par des rétrovirus porcins, ce qui indique potentiellement une telle possibilité de transplantation. En guise de solution, ils ont proposé un prétraitement des cellules avec CRISPR-Cas9 et une excision complète de tous les fragments viraux de la culture de cellules d'épithélium rénal porcin.
Biotech et risques
Il est difficile de prédire où tout cela mènera. Malheureusement, les risques d'obtenir un mutant viral exotique à partir d'une telle greffe sont loin d'être nuls. Et il y a une chance qu'une telle infection puisse également se propager silencieusement et imperceptiblement, avant qu'elle ne devienne évidente, comme cela s'est produit à l'époque avec le VIH. Et pourtant je suis plutôt optimiste. Nous marcherons inévitablement sur beaucoup de râteau dans le processus de recherche, mais maintenant nous avons les outils pour traiter des maladies auparavant mortelles et prolonger la vie humaine.
